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第二法福林酚法(1^ * 17法>

本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與

C u 2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬

酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在

一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)

照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的

含童。

本法靈敏度高，測(cè)定范圍為20.25C^ g。但對(duì)本法產(chǎn)生

干擾的物質(zhì)較多，對(duì)雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生干擾的離子，同樣容易

干擾福林酚反應(yīng)，且影響更大。如還原物質(zhì)、酚類(lèi)、枸櫞

酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘

油等均有干擾作用。

除另有規(guī)定外，按方法1操作；如有干擾物質(zhì)時(shí)，除另

有規(guī)定外，按方法2操作并需經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證。

方法1:

試劑堿性銅試液取氫氧化鈉I0 g，碳酸鈉50g，加

水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml

使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混

合作為乙液。臨用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。

對(duì)照品溶液的制備除另有規(guī)定外，取血清白蛋白（牛）

對(duì)照品或蛋白質(zhì)含量測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并制成每

lm l中含0. 2mg的溶液。

供試品溶液的制備照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備（蛋

白質(zhì)濃度應(yīng)與對(duì)照品溶液基本一致）。

測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、

0. 6mK 0.8ml、1. Oml(對(duì)照品溶液取用量可在本法測(cè)定范

圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），分別置具塞試管中，各加水至l.Otnl,

再分別加入堿性銅試液1 .0 m l,搖勻，室溫放置1 0分鐘，

各加人福林酚試液[ 取福林試液中的貯備液（2m o l/L酸濃

度）1—16] 4 .0 m l,立即混勻，室溫放置3 0分鐘，照紫外-

可見(jiàn)分光光度法（通則0401)，在650mn的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光

度；同時(shí)以0 號(hào)管作為空白。以對(duì)照品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)

的吸光度計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，

同法測(cè)定。從線(xiàn)性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃

度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。